感受態細胞(competent cell):理化方法誘導細胞,吸收周圍環境中的DNA分子,使其處于適攝取和容納外來DNA的生理狀態。
主要原理就是通過處理使細胞的通透性變大,直觀的說,使得細胞膜表面出現一些孔洞,便于外源基因或載體進入感受態細胞。由于細胞膜的流動性,這種孔洞會被細胞自身所修復。
目前,感受態細胞的制備常用冰預冷的CaCl2處理細菌的方法制備,即用低滲CaCl2溶液在低溫(0℃)時處理快速生長的細菌,從而獲得感受態細菌。此時細菌膨脹成球形,外源DNA分子在此條件下易形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物粘附在細菌表面,通過熱激作用促進細胞對DNA的吸收。轉化效率可達106-107轉化子/微克DNA。
本方法的關鍵是選用的細菌必須處于對數生長期,實驗操作必須在低溫下進行。
操作:
1、取-70℃冰凍菌種,用劃線法接種細菌于培養皿,做好標記,于37℃培養過夜。
2、第二天,從平板上挑取單個菌落,接種至含有3ml LB培養液的試管中,37℃振蕩培養過夜。次日取菌液1ml接種至含有100ml LB培養基的500ml燒瓶中,37℃劇烈震蕩培養約2~3小時(200~300r/min)
3、當菌落600nm OD值達到0.3-0.4時,將燒瓶取出放置冰上10~15分鐘。在無菌條件下把菌液倒入50ml離心管中。4℃,4000g離心10分鐘。
4、棄上清,將管倒置于干濾紙上1min,吸干殘留的培養液。加10ml 0.1M的CaCl2到離心管中,振蕩混勻,懸浮菌體,冰浴30分鐘。
5、4℃,4000g離心10分鐘,棄上清,將管倒置于干濾紙上1min,吸干殘留的培養液。加4ml冰預冷的0.1M的CaCl2,重懸浮菌體。每管0.2ml分裝,至4℃保存備用,24-48小時內使用效果較好。如果暫時不用,可再保存于-70℃的低溫冰箱中。